點突變試劑盒1.0說明書

上海起發(fā)生物科技有限公司（Shanghai BioHub Biotechnology Co., Ltd.）屬于上海起發(fā)實驗試劑有限公司（2009年成立）旗下的子公司，成立的初衷是建立上海起發(fā)生物自有品牌，打造優(yōu)質(zhì)的生物試劑民族自有品牌。降低成本的同時，把好生物產(chǎn)業(yè)鏈中的國產(chǎn)生物試劑品質(zhì)關(guān)。未來讓每一個和我們一樣擁有民族情懷的企業(yè)，共同創(chuàng)世界優(yōu)秀的中國生物制造企業(yè)，圓夢中國。

產(chǎn)品詳情

產(chǎn)品描述

本試劑盒可以在質(zhì)粒DNA序列中任意位點引入特定的定突變，包括堿基插入、堿基deletion、堿基變換等。

首先用高保真DNA聚合酶與帶有突變堿基與硫代修飾的引物，PCR擴增野生型質(zhì)粒，將質(zhì)粒線性化并引入突變位點，然后用化學(xué)重組試劑將質(zhì)粒重組成環(huán)狀質(zhì)粒。擴增質(zhì)粒的一對引物各自5'末端的10-12個堿基互補配對，用于重組環(huán)化質(zhì)粒。將帶有突變堿基的線性化質(zhì)粒PCR產(chǎn)物用化學(xué)重組試劑處理環(huán)化質(zhì)粒，然后進行DH5a轉(zhuǎn)化，完成基因定點突變。

本公司化學(xué)法突變試劑盒含有高保真DNA聚合酶2XPCR Mix、化學(xué)重組試劑，可以從頭到尾完成整個實驗，極大的方便了實驗操作。另有無高保真DNA聚合酶2XPCR Mix的化學(xué)法突變試劑盒。

產(chǎn)品特點

DNA定點突變，包括堿基插入、堿基deletion、堿基變換等。

產(chǎn)品組分

使用方法

使用方法

01. 設(shè)計突變引物

引物設(shè)計總原則：在正反向擴增引物的5'端引入末端互補同源序列，使擴增后的線性化質(zhì)粒片段5'和3'末端帶有10-12個堿基的同源序列，用于重組環(huán)化質(zhì)粒。

l 正向擴增引物設(shè)計原則：5'-末端同源序列+突變位點+硫代修飾位點+目標(biāo)序列特異性正向配對序列-3'

l 反向擴增引物設(shè)計原則：5'-末端同源序列+突變位點+硫代修飾位點+目標(biāo)序列特異性反向配對序列-3'

l 正／反向擴增引物與質(zhì)粒模板的特異性配對序列Tm值55-65℃為佳，末端同源區(qū)序列長度為10-12 個堿基（一般情況同源區(qū)10個堿基足以）。

l 一般引物不需PAGE純化，如果最終引物長度超過40 bp，推薦合成時選用PAGE純化，有助于提高PCR與點突變成功率。

02. 反向PCR擴增線性化質(zhì)粒，并引入突變位點

為了防止突變位點之外的堿基額外突變，確保使用高保真聚合酶進行反向PCR。50ul的PCR體系中，推薦使用1-5ng 環(huán)狀質(zhì)粒模板。限制性內(nèi)切酶DpnI處理PCR產(chǎn)物，可以降低野生型質(zhì)粒形成的克隆數(shù)。由于本突變試劑盒效率高，可省略DpnI消化處理，對突變成功率影響不大。

03. 重組環(huán)化反應(yīng)的線性化質(zhì)粒使用量

無需精確計算化學(xué)法重組反應(yīng)的線性化質(zhì)粒PCR產(chǎn)物加入量，一般使用3-5ul。

04. 質(zhì)粒重組環(huán)化反應(yīng)

（1）室溫配制以下反應(yīng)體系：

組分            重組反應(yīng)^a     陰性對照^b       陽性對照^c

線性化質(zhì)粒       X μl           X μl              5 μl

化學(xué)重組試劑     2 μl           0 μl              2 μl

ddH₂0         to 10 μl        to 10 μl           to 10 μl

a. 割膠純化的PCR產(chǎn)物進行重組反應(yīng)時，一定在重組反應(yīng)體系中加入1/10體積的化學(xué)重組Buffer

b. 用來確認(rèn)野生型環(huán)狀質(zhì)粒殘留，推薦進行。

c. 突變線性質(zhì)粒DNA陽性對照反應(yīng)可用來排除其他實驗材料及操作因素的影響。

（2）輕柔混勻后，在70℃反應(yīng)8-10 min，置于室溫或冰上冷卻。

u 在PCR儀及其它加熱儀器上進行反應(yīng)，重組環(huán)化效率在反應(yīng)8-10 min左右達到最高。

u 重組環(huán)化產(chǎn)物可于-20℃存放1個月，待需要時解凍轉(zhuǎn)化即可。

05．重組環(huán)化質(zhì)粒產(chǎn)物轉(zhuǎn)化

u 在冰上解凍克隆感受態(tài)細(xì)胞，冰上放置15min

u 取5ul重組環(huán)化產(chǎn)物加入到50ul感受態(tài)細(xì)胞中，輕彈管壁混勻(請勿振蕩混勻)，冰上靜置15-20 min。重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化體積最多不應(yīng)超過所用感受態(tài)細(xì)胞體積的1/5；

u 42℃水浴熱激1-2min后，立即置于冰上冷卻1- 2 min。

u 加入450 μl SOC或LB培養(yǎng)基(不添加抗生素)，37℃搖菌30min-1h (轉(zhuǎn)速200 - 250 rpm)。

u 將相應(yīng)抗性的LB平板固體培養(yǎng)基在37℃培養(yǎng)箱中預(yù)熱30min（可省略）。

u 直接吸取20-100ul菌液到含有正確抗性的平板上，用無菌涂布棒涂勻。

37℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 - 16 h。

06．點突變測序鑒定

u 過夜培養(yǎng)后，重組環(huán)化反應(yīng)轉(zhuǎn)化平板上形成數(shù)百個單克隆，而不加化學(xué)重組試劑的陰性對照反應(yīng)轉(zhuǎn)化平板上的克隆數(shù)應(yīng)顯著少于前者。

u 挑取重組反應(yīng)轉(zhuǎn)化平板上2-3個克隆進行DNA序列測定，驗證是否突變成功。

注意事項

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作！

本產(chǎn)品主要用于科研領(lǐng)域，不宜用于臨床診斷或其他用途。

運輸及保存方法

干冰運輸。-20℃保存，有效期2年。