aatbio Covidyte™ TF670說明書

Covidyte™ TF670

概述

冠狀病毒 (CoV) 可以感染人類和多種動物，引起廣泛的疾病。2019 年底，一種被稱為嚴重急性呼吸系統綜合癥冠狀病毒 2 (SARS-CoV-2) 的冠狀病毒被確定為導致幾例呼吸系統疾病 (Covid19) 的原因。該病毒在全球范圍內迅速傳播。它已經感染了超過 100 萬人，Covid19 已造成 7 萬多人死亡（截至 2020 年 4 月 6 日）。目前，沒有任何具體有效的治療 Covid19 的選擇。目前，Covid19的臨床治療主要是對癥聯合對已上市的抗病藥物如瑞德西韋和抗生素進行再利用來治療繼發感染。Covidyte™ TF670 是一種包含 14 個氨基酸序列 (KTSAVLQSGFRKME) 的肽底物，可被冠狀病毒蛋白酶切割。dark-FRET 肽在 N 端和 C 端分別含有 Tide Quencher™ 5 (TQ5) 作為猝滅劑和 Tide Fluor™ 5 (TF5) 作為熒光供體，其中 TF5 的熒光在肽段被 TQ5 有效猝滅時完好無損。當肽被冠狀病毒蛋白酶水解時，TF5 片段會產生顯著增強的熒光，因為它的熒光不再被 TQ5 淬滅。TF5的熒光強度可以有效監測冠狀病毒蛋白酶的活性。Covidyte™ TF670 是一種*的高通量篩選工具，用于搜索冠狀病毒蛋白酶的抑制劑。TQ5-TF5 對已被證明是用于開發 FRET 蛋白酶底物的極為有效的 FRET 對。與常用的 EDANS 底物（如 Covidyte™ EN450）相比，TF670 底物具有更強和更長的熒光，較少受有色化合物的干擾，而這些有色化合物通常會導致假陽性命中。

示例協議

準備解決方案

除非另有說明，否則所有未使用的儲備溶液應分成一次性使用的等分試樣，并在制備后儲存在 -20°C。避免重復凍融循環。

Covidyte™ TF670 原液 (200X)

將 25 µL（對于 cat# 13540）或 250 µL（對于 cat# 13541）DMSO 添加到 Covidyte™ TF670 小瓶中。
注意     制作一次性等分試樣并儲存在 -20 °C。

準備工作解決方案

1. Covidyte™ TF670 工作液

在 20 mM Tris 緩沖液 (pH 7.5) 或您選擇的緩沖液中以 1:200 稀釋底物儲備溶液。在 96 孔板中每次測定使用 50 μL 的底物溶液。

2. 冠狀病毒蛋白酶稀釋

根據需要稀釋冠狀病毒蛋白酶。

示例實驗協議

一個 96 孔板的樣品協議

1. 將 50 μL 的每種蛋白酶稀釋液添加到檢測板的各個孔中。
   

2. 在每個蛋白酶稀釋液中加入 50 μL Covidyte™ TF670 工作溶液。
   

3. 在 Ex/Em = 640/680 nm（截止 660 nm）處使用熒光讀板器監測熒光增加。 

對于動力學讀數：立即開始連續測量熒光強度，每 5 分鐘記錄一次數據，持續 30-120 分鐘。
對于終點讀數：在所需溫度下孵育反應 30 至 120 分鐘，避光。然后測量熒光強度。

示例數據分析和數據

圖 1.蛋白酶在蛋白質激活、細胞調節和信號傳導以及生成用于蛋白質合成或在其他代謝途徑中利用的氨基酸中發揮重要作用。FRET 蛋白酶底物廣泛用于檢測蛋白酶活性，特別是對于通常需要長肽序列以實現最佳結合的病毒蛋白酶，例如冠狀病毒、HIV 和 HCV 蛋白酶。內部猝滅的 FRET 肽底物被蛋白酶消化以產生高熒光肽片段。熒光增加與蛋白酶活性成正比。Tide Quencher™ 染料與我們明亮的 Tide Fluor™ 和 iFluor™ 染料一起被證明是開發 FRET 蛋白酶底物以用于高通量篩選應用的極其有效的淬滅劑。

圖片

圖 1.蛋白酶在蛋白質激活、細胞調節和信號傳導以及生成用于蛋白質合成或在其他代謝途徑中利用的氨基酸中發揮重要作用。FRET 蛋白酶底物廣泛用于檢測蛋白酶活性，特別是對于通常需要長肽序列以實現最佳結合的病毒蛋白酶，例如冠狀病毒、HIV 和 HCV 蛋白酶。內部猝滅的 FRET 肽底物被蛋白酶消化以產生高熒光肽片段。熒光增加與蛋白酶活性成正比。Tide Quencher™ 染料與我們明亮的 Tide Fluor™ 和 iFluor™ 染料一起被證明是開發 FRET 蛋白酶底物以用于高通量篩選應用的極其有效的淬滅劑。

圖 2. Covidyte™ TF670 的化學結構。